2018电镜网络会60个提问与专家解答：看电镜

　　2018年7月24日-26日，仪器信息网组织举办了电子显微学网络会议(iCEM 2018)，并围绕广大用户感兴趣的技术领域组织报告，分设了电子显微学理论、技术及仪器进展、电子显微学仪器维护保养与制样技术、电子显微学仪器在材料科学领域的应用、电子显微学仪器在生命科学领域的应用4个主题专场。邀请到20位电子显微学仪器专家及厂商技术研究人员进行报告并与参会者进行在线互动沟通。会议报名人数突破2400人次，参会者突破1500人次。

　　在线报告过程中，在线参会者积极互动，与报告专家就报告内容进行了一系列提问、交流互动。近日，仪器信息网论坛中，按报告顺序截取其中60个现场提问问题及对应专家解答并发帖互动，引起了网友广泛关注（帖子链接：

　　）。以下再次将60个现场提问问题及对应专家解答，罗列下来，共享读者，以期侧面看到当下电镜一线用户的需求，以及电镜技术需求的热点。

　　答：报告中提到，微纳尺度在电子显微镜当中，也不只是微纳尺度，而是跨尺度的连续表征。从透射电镜的原子尺度到扫描电镜的毫米尺度都可以进行力学性能表征。这样的话我们认为，只要把跨尺度的系列测试做完，应该和样品整体的物理和力学性能有相关性，是可以代表样品的整体性能。

　　5、 张老师，您好普通的电镜如S-4800也可以配特殊原位夹具，开展力学性能原位测试?有商业化的夹具?

　　6、 张老师，请问材料力学性能变化和电子结构变化之间的关系能用原位力学透射电子显微学研究么?目前有研究么?

　　激光光谱：每个荧光物质有一个最佳的激收峰，但能够激发这个荧光物质发射出荧光也是有一个光谱的范围。

　　2、 老师，您好，虽然双光子增加了光穿透深度，小鼠的confocal测量还是必须把皮层剥离，是吧?

　　答：不需要。只需要开个颅窗，把骨头磨薄或者磨穿就可以。如果想做到皮层下更深度的成像，是可以在保持小鼠活着的状态下把皮层剥离，这也是个比较新的技术。

　　答：在材料的这个电镜当中，可能会有一些非常硬的物体比较难切。对于生物样品来说呢，一般我们不会做很硬的物体，当然如果有一些那个组织非常硬，比如说昆虫的背板。对于比较硬的物体，像种子，都要进行前处理，很多组织要进行脱钙进行软化。如果过硬的话，不仅是超薄切片刀能不能切得问题，而是因为没有办法很好的渗透，没有办法较好的钻中包埋块?没有办法形成很好的切片，切得时候不容易形成切片，有可能变成粉末落下了。到底能切多硬的物体不确定，对于生物样品来说肯定是不行的，要进行前处理的，软化，以便做成完美的包埋块，然后去切。

　　答：对于贴壁细胞，如果要看原始样子的话，一般做原位固定(也就是说不离心收集)，直接在原位对它进行固定、脱水等处理，最后原位固定之后形成一个薄层在这个上面直接做切片。

　　做切片细胞最好的是做高压冷冻，就是直接把它培养在高压冷冻需要的蓝宝石片上，之后进行高压冷冻的固定，后期进行冷冻替代的处理，这个是比较好的处理方法。

　　3、 老师您好，您PPT的冷冻替代图中显示是从-90℃开始的，请问样品从液氮温度直接转入到-90℃的替代过程中不会产生冰晶吗?

　　但是从之前液氮温度到-90℃这个温度的过程中，样品不是从液氮中拿出来，放到室温，再放入-90℃中，而是在液氮中转移到冷冻替代剂中的。当然在液氮(-196℃ )的冷冻中替代剂是固态，把样品放在冰上，设好温度，慢慢的升温到-90℃，一旦到-90℃，冷冻替代剂融化后样品就会掉到里边。因为对于细胞内的样品来说，重结晶的温度大概是在-70℃，所以不会产生冰晶。

　　答：加起来大概是将近100万，但是我们这个是冷冻切片器，所以如果是常温应该没那么多钱，但是具体多少钱，要问一下这个销售人员。

　　目前我们也在做这方面的工作，现在很具体的手段我不能透露。但是每个实验室都会设计一些自己的方法，针对这些方法自己的一些工具等等，但是可以实现

　　答：对于一些常规的不涉及到特殊组织的动物样品来说，因为没有细胞壁所以制样时间相对短一些。植物样品由于细胞壁，每一步都相应的长，包括脱水、渗透。而且一般需要在旋转仪上不停的搅动以利于它的脱水和渗透。

　　此外，所用树脂不一样。动物样品倾向于用812树脂，因为它的切割性能很好，同时在电子的照射下，形变最小，好切好看。但是呢，812树脂的粘度较大，对于有细胞壁的植物样品来说，它的渗透没有那么好。所以植物样品一般用粘度更小的spurr树脂。

　　答：材料切片没有那么复杂，因为不存在脱水的过程。但是材料样品性质，软硬度不同，有时候会难切。但是方法很多。

　　答：挺好的，对于比较难于渗透的样品，像线虫在没有高压冷冻前用微波组织处理技术，能够进行很好的渗透。 所以这个技术任然是很有用的技术。

　　答：导电胶是把导电的碳颗粒分散到溶剂(水中，有机溶剂通常是异丙醇)当中，制样要点是将导电胶涂在台子上，然后把样品颗粒放到导电胶上，在导电胶凝固的过程中，样品能陷入到导电胶中，增加导电性。

　　2、 关老师，您好，我想问一下扫描电镜制样的液体碳胶的选择，水溶剂的和有机溶剂(异丁醇)的使用有什么区别，如何选择?

　　5、 关老师，请问用金属环捞片时，金属环有材质要求吗?金属环中间是有支持膜还是就是一个中空的环?

　　5、 老师您好，三价和4价Ti的近边结构有什么区别么?能量分辨率选多大的比较适合分析价态精细结构。

　　答：不清楚用在哪个方面。报告中提到的是在二氧化硅颗粒上浸渍催化活性组分，比如银，这样可以增加银的分散度，另外由于二氧化硅是球形的，可以增加比表面积，从而提高催化活性。

　　2、 欧拉角转换密勒指数时。得到的指数(hkl)是归一化指数，怎么换算成素质的整数(HKL) (参考杨平老师 书)?

　　答：一般取决于晶粒大小。如果晶粒大小是150nm，步长设成100个nm，需要8、9个小时;如果晶粒大小是几十个微米，步长设成30个微米，做同样的范围，就会节省很多时间。

　　答：电子束在每一个像素点都扫，每个像素点得到一个菊池花样。之后跟数据库的晶面夹角来比对，来标定每一个菊池晶面。确定晶面后，就能标定曲轴(晶带轴)，就能测出到底是哪个晶面平行于样品的xy平面，哪个晶向平行于x轴，就能想出一个立体的空间，这一点对应的单胞是怎样的空间分布。同样的取向对应同样的晶粒。

　　8、EBSD和电子衍射相比，能大范围给出晶体结构信息，还有什么优势呢?是不是数据分析比电子衍射要复杂?

　　答：优势是EBSD对取向特别敏感，0.1度的取向变化都检测出来。但是电子衍射不敏感，变几度只是衍射斑点的强度产生了变化。

　　1、 老师您好，请问切片的保质期是多久?能达到几年麽?染色和未染色的切片保质期一样麽?如果不染色想去看电镜，可以麽?我做的化学固定的切片，特别容易褶皱，请问这是什么原因啊?答：如果保存的好，避光干燥保存，几年没问题。需要防尘。

　　可能由于切片块的软硬度跟样品不匹配，此外要考虑纯树脂的区域和样品的区域是否一致，如果不一致，也容易褶皱。

　　2、 老师，我们在取材的时候，实在很难达到1毫米立方大小，最好的情况也得2-3毫米，这会影响研究么?

　　4、 老师好，请问三维重构渲染是如何操作呢?利用了什么软件?切片厚度有没有一个极限值，最厚及最薄是多少?

　　Amira常用。根据切片方法来说，像超薄切片机最薄30纳米以上，如果刮掉表面要片的话，厚度可以到十几个纳米，连续切片关注的是均匀。

　　1、 孙老师，您好，我刚开始学习超微结多超微结构的照片信息量很大，经常无法全面分析其中的所有内容，比如电镜照片各不相同，如何全面的学习超微结构这门学科呢?谢谢!答：如果做超微病理诊断的医生，需要有很全面的知识，组织学，解刨学，病理学的基础。

　　2、 老师您好，请问对于入门者来说，如何全面学习和掌握电镜超微结构这门学科呢?因为照片信息量太大，如何更好更准确分析呢?谢谢!

　　3、您好，孙老师，肿瘤的鉴别诊断有很多方法，光镜下无法区分，我们可以特染，那我们什么情况下使用电镜观察?

　　答：有些今天没有涉及到的一些工作，比如说肿瘤方面，神经内科，外周神经和肌肉方面的诊断工作，确实是光镜下边没法区分。比如说做免疫组织化学的研究没有很精确的抗体进行染色，就只能用电镜观察。

　　7、脑组织特别容易溶解，灌注都较难保存超微结构，临床怎样尽可能保存好手术标本怎样，克服自溶的难题?

　　1、 老师，您好，请教您一个基础问题，为什么不直接用很多照片直接三维重构，还要有傅里叶变换和逆傅里叶变换过程?答：在冷冻电镜的情况下，由于它的背景是冰,元素是H,O，生物分子的元素是C,H,O,

　　两者相比，实际上元素组成都是H元素，衬度很差，也就是说在电镜图像上，很难直接看到生物分子的图像，因此得到三维结构，首先要进行图像处理，提高信噪比，这里要用到傅里叶变换和逆傅里叶变换。另外在三维重构里也要用到，电镜图像是三维物体的一个投影图像(也就是说三维图像压缩到二维平面上的一个叠加的图像)。得到三维结构需要数学处理，中央截面定理只有在傅里叶空间成立，在时空间(电镜图像)是不成立的。因此要进行傅里叶变换，再做逆傅里叶变换才能得到三维图像。

　　答：由于电镜照相的不完美性，透镜会对图像产生调制作用，从而改变衬度。衬度的改变和频率空间有关，有正有负，因此需要进行校正。很据不同高度进行CTF校正就是Nova CTF。

　　答：这取决于有机高分子是不是均一的，即所有高分子都是同样的分子，大小是否足够的大，最小的分子是60kD。如果你的有机高分子可以形成聚积体，比如微团，如果大小均一的线、 冷冻固定/包埋的具体步骤能详细介绍下吗?谢谢!

　　答：利用装置使空气中的分子电离，之后打到电镜铜网膜的表面，把疏水的分子去除掉，同时带电的空气分子会附着在膜表面，由于带电，自然就变成亲水表面了。合适，只要样品是在水溶液中，电镜的载网都需要进行亲水处理。